AMSI RAHMANTA1, SITI KARIMAH2, CAHYA PRIHATNA3
1) Laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia, Pusat Antar Universitas Bioteknologi IPB, Bogor
2)Laboratorium Mikrobiologi, Jalan Raya Pajajaran, Bogor, 16144
3)Laboratorium Biologi Molekuler Seameo-Biotrop, Jalan Raya Tajur, Bogor
Abstrak
Bakteri filosfer yang berhasil diisolasi, mempunyai kemampuan nukleasi es ditunjukkan oleh isolat yang berasal dari tanaman yang tidak diketahui namanya, yang dapat membekukan air menjadi es pada suhu –10o C dalam waktu 5 menit. Isolat tersebut merupakan 1 dari 12 isolat yang didapat. Isolat tersebut diisolasi dengan cara membuat replika daun dan pembentukan suspensi pada buffer fosfat daslam medium King’s B. isolat yang didapat diuji nukleasi esnya dengan memasukkan satu lup isolat pada buffer fosfat dan dinkubasi di dalam alcohol circulating bath pada suhu –10o C selama 5 menit. Uji positif ditandai dengan terbentuknya es pada buffer fosfat.
Latar Belakang
Keragaman bakteri bisa dilihat dari berbagai macam sudut pandang, seperti morfologi, fisiologi, dan genetik. Tiap-tiap habitat yang berbeda memberikan keragaman yang berbeda pula. Contohnya adalah daun, habitat yang banyak dihuni oleh bakteri. Tiap tanaman mempunyai daun yang berbeda, baik bentuk, ukuran, maupun eksudat yang dikeluarkannya. Perbedaan ini menyebabkan mikrob yang menghuni juga berbeda.
Bakteri yang mendiami permukaaan daun sangat bervariasi sesuai dengan jenis tanamannya oleh karena setiap tanaman menghasilkan eksudat tertentu yang sesuai dengan bakteri tertentu. Variasi tanaman dari dataran rendah ke dataran tinggi menyebabkan variasi bakteri yang hidup pada permukaan daunnya. Dari bakteri-bakteri yang menghuni permukaan daun salah satu diantaranya adalah bakteri pembentuk inti kristal es yang meliputi lima galur bakteri, yaitu ; Pseudomonas syringae, Pseudomonas viridiflava, Pseudomonas fluoresces, Erwinia herbicola, dan Xantomonas campestris pv translucens. Kelima spesies ini mampu mengkatalisis pembentukan es pada suhu di atas -10C, bahkan ada yang dapat membentuk es pada suhu –1,5C. Kehadiran spesies-spesies ini pada permukaan tanaman (daun) dapat menyebabkan terjadinya luka beku (frost injury) pada temperatur di atas suhu –5C. Pembentukan inti es oleh bakteri ini di habitat alaminya merupakan fenomena yang menarik (Gurian-Sherman dan Lindow 1993).
Kehadiran bakteri pembentuk kristal es pada permukaan daum pada pohon-pohon bertajuk lebar di dataran tinggi misalnya tegakan-tegakan pada hutan hujan tropis diperkirakan dapat bertindak sebagai inti kondensasi yang menginisiasi terbentuknya hujan. Dan hasil penelitian menunjukkan bahwa kehadiran bakteri ini pada permukaan daun semakin berkurang dengan semakin tingginya suhu lingkungan sehingga makin jarang dijumpai pada dataran rendah (Wilson dan Window 1994). Taman Nasional Gunung Gede Pangrango (TNGP) adalah hutan hujan tropis yang kaya akan vegetasi dan mempunyai temperatur udara yang relatif rendah. kondisi ini memungkinkan peluang besar untuk menemukan bakteri filosfer pembentuk kristal es dan melakukan uji aktivitas nukleasinya.
Bakteri filosfer pembentuk inti es diketahui mempunyai potensi yang besar misalnya untuk membuat hujan dan salju buatan, industri pengawetan makanan dan minuman dengan pembekuan, dan rekayasa gen pelapor (reporter gene engineering). Disamping itu dalam bidang pertanian, bakteri pembentuk es juga diketahui penyebab luka beku (frost injury) tanaman komoditi (Suwanto 1994; Wahyudi AT 1995; Lindow 1989). Mengingat peran dari bakteri pembentuk inti es tersebut, pemanfaatan bakteri ini secara praktis maupun aplikasi ilmiahnya mempunyai arti yang penting. Disamping itu pemahaman mengenai protein yang berperan dalam pembentukan inti es dan faktor-faktor yang mempengaruhi inti es juga perlu dipahami.
Tujuan
Tujuan praktikum ini adalah untuk mengisolasi bakteri filosfer dari sejumlah daun yang ada di Puncak Gunung Pangrango Eidelweis (Anaphalis javanica), Cantigi Gunung, dan daun yang belum diketahui namanya, serta menguji aktivitas nukleasi es dari sejumlah isolat yang dihasilkan.
Waktu dan Tempat
Praktikum ini dilaksanakan pada bulan Oktober-November di laboratorium Mikrobiologi dan Biokimia Pusat Antar Universitas (PAU) Bioteknologi IPB, di Dramaga.
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan adalah sampel daun Eidelweis (Anaphalis javanica), Cantigi Gunung, dan daun yang belum diketahui namanya yang diambil dari puncak Gunung Pangrango (3.019 m dpl), media Kings’B Agar, agar bakteriologi, dan buffer fosfat. Alat yang digunakan adalah alkohol circulating bath, vorteks, cawan agar, tabung reaksi, dan alat-alat umum laboratorium mikrobiologi.
Metode
Pengambilan sampel
Sampel daun dipotong dengan menggunakan gunting steril kemudian dimasukkan ke dalam plastik steril dan langsung dibawa ke laboratorium untuk isolasi bakteri.
Isolasi bakteri filosfer
Dengan membuat replika daun. Sebanyak satu helai daun (sampel) diletakkan pada media Kings’B agar (20 g protease peptone, 15 mL gliserol; 1.5 g K2HPO4; 1.5 g MgSO4.7H2O; 20 g agar bakteriologi; akuades 1 liter). Daun ditekan pelan dan dibiarkan sebentar sampai terbentuk replika pada media tersebut. Hal yang sama dilakukan untuk permukaan daun yang berlawanan. Kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama dua hari, lalu koloni yang terbentuk dimurnikan dengan medium yang sama.
Pembentukan suspensi pada buffer fosfat. Satu helai daun dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 5 mL mM buffer fosfat kemudian divorteks selama 30 detik supaya bakterinya terlepas dan tersuspensi. Kemudian dibuat pengenceran serial 10-1, 10-2, 10-4, dan 10-6 dan disebar pada media Kings’B agar, dan diinkubasi selama 2 hari pada suhu kamar. Koloni yang terbentuk dimurnikan dengan medium sama.
Essei Nukleasi Es
Satu lup koloni yang terpisah diambil dan dimasukkan ke dalam 500 μL buffer fosfat steril dalam eppendorf dan divorteks hingga suspensinya homogen. Kemudian diambil 100μl dari suspensi tersebut dan dimasukkan ke dalam 10 ml buffer fosfat steril dalam tabung reaksi. Tabung-tabung ini kemudian dimasukkan ke dalam circulating alkohol bath pada suhu -10°C selama 5 menit. Untuk kontrol positif digunakan Xanthomonas campestris. Parameter yang diamati adalah terbentuknya es pada masing-masing medium.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Percobaan
Pertumbuhan Bakteri pada media KB
Nama daun Jumlah isolat Kemampuan nukleasi es
Tidak diketahui namanya 4 +
Eidelweiss 8 -
Cantigi Gunung 0 -
Keterangan: kontrol positif = Xanthomonas campertris
+ = terbentuk es
- = tidak terbentuk es
Umur dan luas permukaan daun
Nama Daun Umur Luas
permukaan
Tidak diketahui namanya Tua 46 cm2
Eidelweiss Muda 2,7 cm2
Cantigi Gunung Muda 4,8 cm2
Pembahasan
Dalam praktikum ini digunakan sampel daun yang diambil dari puncak Gunung Pangrango dengan ketinggian 3.019 meter di atas permukaan air laut. Dipilihnya tempat tersebut untuk pengambilan sampel karena mempunyai topografi yang tinggi dan suhu yang rendah, sehingga peluang untuk menemukan bakteri filosfer lebih banyak, karena dari penelitian sebelumnya diketahui bahwa populasi bakteri filosfer akan turun dengan semakin tingginya suhu lingkungan sehingga jarang ditemukan pada dataran rendah (Wilson & Lindow 1994).
Sampel daun yang diambil adalah Cantigi Gunung, Eidelweiss (Anaphalis javanica), dan satu daun yang tidak diketahui namanya (untuk selanjutnya disebut daun X). Dari ketiga daun tersebut diperoleh hasil satu isolat yang mampu membentuk nukleasi es pada suhu -10C selama 5 menit. Isolat tersebut berasal dari daun yang tidak diketahui namanya. Terbentuknya nukleasi es pada suhu tersebut belum bisa disimpulkan bahwa isolat tersebut adalah bakteri pembentuk kristal es, karena pada suhu tersebut banyak material yang dapat menjadi inti pembentukan es (Suwanto 1994). Namun kekhawatiran mengenai hal ini terbantah dengan adanya perlakuan pada isolat dari daun yang lain yaitu daun Eidelweiss (Anaphalis javanica). Seandainya yang menjadi inti pembentukan kristal es pada isolat dari daun X tersebut bukan berasal dari protein INA dan berasal dari materi selain itu, maka bisa dipastikan bahwa isolat dari daun Eidelweiss juga akan membentuk nukleasi es. Tapi ternyata dari kedua isolat yang diujikan hanya satu yang dapat membentuk nukleasi es, yaitu dari daun X. Dengan demikian dapat diasumsikan bahwa isolat tersebut adalah benar bakteri nukleasi es. Untuk mengetahui kemampuan nukleasi es lebih lanjut perlu dilakukan verifikasi protein INA, karena protein ini yang paling berperan dalam nukleasi es pada bakteri (Wilson & Lindow 1994; Wahtudi AT 1995; Suwanto A 1994).
Ditemukannya isolat positif nukleasi es pada daun X tidak lepas dari pengaruh umur jaringan daun. Daun X yang diambil umurnya lebih tua (ditunjukkan dengan warna hijau tua), daunnya lebih tebal, dan permukaannya lebih luas dibandingkan kedua daun lainnya.Umur berpengaruh terhadap eksudat yang dikeluarkan, yaitu semakin tua daun maka eksudat gula maupuan asam amino yang dikeluarkan juga akan semakin banyak, sehingga bakteri lebih suka menghuni daun yang tua. Pada Eidelweiss, jaringan daun yang diambil tergolong masih muda (dekat ujung apeks karena masih melekat calon bunga) dan permukaan daunnya kecil sehingga wajar jika populasi bakteri rendah dan waktu uji aktivitas nukleasi menunjukkan hasil negatif.
Populasi bakteri pembentuk nukleasi es sangat dipengaruhi oleh jumlah populasi, sedangkan jumlah populasi dipengaruhi oleh luas permukaan daun. Pada daun Cantigi Gunung permukaan daunnya relatif kecil (kurang lebih 2.7 cm2), jauh lebih kecil dari daun X (kurang lebih 46 cm2), sehingga mungkin saja hal ini mempengaruhi populasi bakteri yang menghuninya. Sekitar 0.1%-1% dari total permukaan daun dihuni oleh bakteri, sedangkan sisanya mati karena desinfektan topikal. Dari total bakteri yang ada diketahui hanya 1/1000 dari populasi yang membentuk nukleasi aktif. Pada kasus daun Eidelweis maupun Cantigi, bukan berarti tidak ada bakteri pada daun tesebut karena dalam uji aktivitas nukleasi yang paling menentukan adalah populasi total bakteri nukleasi. Untuk dapat membentuk nukleasi es bakteri nukleasi harus mencapai quorum sensing, yaitu jumlah minimal yang harus dipenuhi oleh bakteri. Di bawah jumlah minimal tersebut bakteri tidak mampu membentuk nukleasi es. Hal ini behubungan dengan ptootein INA yang dihasilkan bakteri tesebut. Protein INA merupakan protein unik yang dihamparkan pada membran luar sel bakteri pembentuknya. Protein tersebut disandikan oleh satu gen tunggal yang disebut gen ice atau ina (ice nucleation activity). Efektifitas protein pembentuk kristal es ditentukan oleh penataan dipermukaan membran serta tingkat agregasinya. Pada populasi bakteri yang tinggi, penataan dan agregasinya kompak sehingga jika satu protein sudah membetuk kristal es, maka protein yang lainnya akan lebih mudah terinisisai. Suhu dalam hal ini sangat mempengaruhi, yaitu ketika suhu rendah (kurang dari 0 0C) air berada dalam keadaan metastabil. Kemudian protein INA yang bersifat hidrofilik akan mengkatalisis pembentukan es. Dengan terbentuknya satu kristal es maka protein yang disusun kompak tersebut akan langsung menginisiasi air disekitarnya menjadi es juga.
Eidelweis dikenal sebagai bunga yang tidak mudah layu, sehingga lazim disebut bunga abadi. Kemampuan Eidelweiss untuk tidak mudah layu kemungkinan disebabkan oleh faktor eksudat dan lapisan lilin tebal yang dimilikinya. Eksudat tersebut mungkin lebih berfungsi sebagai senyawaan anti mikrob (bakterisida) yang menghambat pertumbuhan bakteri filosfer permukaan daun. Sedangkan lapisan lilin tebal bersifat hidrofobik juga menghalangi kolonisasi bakteri. Hubungannya dengan bakteri nukleasi es, protein INA bakteri nukleasi es bersifat hidofilik, yang menyukai adanya air pada permukaan daun (Wahyudi AT 1995). Lapisan lilin tebal pada Eidelweiss akan menciptakan kondisi hirofobik, yang sangat bertentangan dengan protein bakteri yang hidrofilik. Faktor lain yang menyebabkan tidak ditemukannya nukleasi es pada isloat daun Eidelweis mungkin karena pengujian hanya dilakukan pada dua isolat sedangkan sisanya tidak diuji karena keterbatasan media.
Media kultur dan inkubasi mempunyai pengaruh penting dalam ekspresi aktivitas inti es dari bakteri nukleasi es. Media kultur yang digunakan dalam penelitian ini, yaitu King’s B agar, sudah cukup bagus untuk pertumbuhan bakteri karena bersifat padat dan mengandung gliserol sebagai sebagai sumber C. Perumbuhan pada media padat diketahui lebih efisien dibanding pertumbuhan pada media cair yang diaerasi (Lindow 1990). Sedangkan waktu inkubasi yang digunakan dalam penelitian ini kurang efektif karena menggunakan suhu kamar (27C). Pada suhu diinkubasi lebih dari 24C frekuensi pembentukan inti es dari bakteri pembentuk inti nukleasi es menurun secara nyata (Lindow 1990).
Adanya protein kristal es berhubungan dengan adaptasi bakteri pada situasi yang berubah dengan cepat. Bakteri yang hidup pada permukaan daun dihadapkan pada cuaca yang berubah secara drastis, seperti radiasi sinar ultraviolet matahari, angin, dan hujan (Suwanto A 1994). Disamping itu bakteri permukaan daun juga harus bersaing dengan bakteri lain untuk mendapatkan nutrisi yang serba terbatas. Untuk itu bakteri nukleasi es harus mempunyai mekanisme pertahanan diri terhadap kondisi tersebut. Mekanisme tersebut salah satunya dengan cara pembentukan nukleasi es. Kristal es yang dibentuk dapat digunakan untuk melukai tanaman sehingga mempermudah penyerapan nutrisi. Kristal es juga dapat digunakan untuk menghambat bakteri lainnya yang memggunakan niche ekologi sama atau untuk pertahanan diri terhadap cuaca yang berubah dengan cepat.
Untuk mengetahui kemampuan nukleasi es sebenarnya dari bakteri pada daun X, dan juga daun-daun lainnya, perlu dilakukan verifikasi protein INA dan pemurnian serta pengkayaan isolat bakteri, sehingga diperoleh densitas bakteri yang murni dan dapat membentuk nukleasi pada suhu yang lebih hangat. Usaha demikian sangat penting untuk aplikasi dalam dunia industri, kesehatan, dan pengaturan iklim mikro dan makro.
DAFTAR PUSTAKA
Gurian-Sherman D and SE Lindow 1988. Bacterial Ice Nucleation: Significance and Molecular Basis. FASEB J. 7:1338-1343.
Lindow SE. 1983. The Role of Bacterial Ice Nucleation in Frost Injury to Plant. Ann.Rev. Phytopathol. 21:363-384.
Lindow SE. 1989. Use of Genetically Altered Bacteria to Achieve Plant Frost Control. hlm. 85-111. University of California at Barkeley: California.
Lindow SE. 1990. Bacterial Ice Nucleation Activity. hlm 428-434. Dalam: Z. Klement K Rudolp and DC Sand, Editor. Methods in Phytobacteriology. Budapest: Academiai Kiodo.
Suwanto A. 23 Oktober 1994. Iptek & Kesehatan : Membuat Hujan dengan Bakteri. Kompas, hlm. 11.
Wahyudi AT. 1995. Pembentukan Inti Es oleh Bakteri. Ulas Balik. Hayati 2:55-59.
